Analyse microbiologique des aliments/Le dénombrement de la Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT)

La FMAT est un indicateur d'hygiène important. En effet, elle permet d'évaluer la charge de la flore mésophile aérobie totale (UFC: Unité Formant colonie) présent dans un produit ou sur une surface. Ce dénombrement se fait à 30°C ce qui permet de dénombrer trois grands types de flore:

• la flore thermophile T° optimale de croissance à 45°C
• La flore mésophile T° optimale de croissance entre 20°C et 40°C
• La flore psycrophile T° optimale de croissance à 20°C

Comme il s'agit d'un milieu ordinaire, la plupart des micro-organismes peuvent se développer, sauf ceux qui sont exigeants et les Micro-organismes anaérobie stricts (contact avec l'air). Il est donc préférable de parler de Flore Mésophile Aérobie à 30°C que de "flore totale". L'unité est l'UFC (Unité Formant colonie)car une colonie observable sur la gélose peut venir d'un micro-organisme isolé, ou bien d'une spore ou d'une micro-colonie.

Dénombrement de la FMAT d'une surface

Il existe plusieurs techniques possible,et sont relativement simples. Selon les inconvénients et les avantages de Chacune de ces techniques, le responsable qualité devra faire des choix

Dénombrement avec une Boite de contact Rodac

Les boites rodac sont des boites de pétris prêtes à l'emploi, avec un milieu gélosé PCA,légèrement bombé et à bord surélevé que l'on pose directement sur une surface. Du TTC est souvent ajouté à la gélose pour stopper les actions des détergent et désinfectant et donc compter les survivants. Une Boite rodac couvre la surface de 20cm². Les boites sont directement incubées à 30°C pendant 24 H , puis le nombre de colonies observables est compté.

Pour les utiliser il faut appuyer la boite de contact sur une surface plane en appuyant légèrement pendant 10 secondes.

• Avantages : peu de manipulations,rapide,et simple.
• Inconvénients : ne peut se faire que sur des surface planes, pleines, et sèches pour éviter une culture en nappe.

Dénombrement avec les écouvillons

Les écouvillons ressemblent à des cotons tiges. Après avoir été trempé dans un tube d'urée tryptophane additionné de TTC, il suffit de le frotter contre la surface et le remettre dans le tube. Après une agitation vive, 1 mL de solution est étalé sur une gélose PCA puis est incubé à 30°C pendant 24 H. Ensuite un dénombrement est effectué.

• Avantages: permet d'aller dans les coins difficiles d'accès.
• inconvénients : besoin d'un étalon de surface métallique qui devra être stérilisé à chaque fois , (ce qui n'est pas toujours faisable), une partie seulement des micro-organismes est dénombrée(une partie reste dans les fibres de l'écouvillon).

Dénombrement par mesure de L'ATP métrie

Cette méthode se base sur le fait que les micro-organismes produisent de ATP, molécule qui permet de fournir de l'énergie aux cellules, et qui a la propriété de se dégrader rapidement quand la cellule meurt. L'ATP sous l'action d'une luciférase, produit un photon (c'est la même réaction qui permet aux lucioles de briller) en considérant que 1 Photon est émise par un ATP , et que la quantité d'ATP est pareille pour chaque micro-organismes, on peut mesurer la lumière émise et dénombrer les microbes.

Le prélèvement se fait toujours grâce à un écouvillon adapté. L'embout est alors plongé dans une cuve de solution enzymatique qui extrait l'ATP et la fait réagir. La Cuve est passée dans un spectrophotomètre qui donne directement le résultat.

• Avantages : Rapide ; moins de 2 minutes, accès aux zones difficiles,
• Inconvénients : Investissement financier important, applicable uniquement aux surfaces et pour certains liquides (eau de rinçage, vin, ...).

Dénombrement de la FMAT d'un produit

Dans un produit alimentaire, on ne peut pas utiliser ces techniques: les micro-organismes sont présents dans la totalité du produit et non pas seulement en surface. Il faut donc prélever un échantillon du produit qui puisse permettre d'apprécier la qualité microbiologique de l'aliment (ex : dans un plat en sauce, on prendra dans les échantillons à analyser aussi bien des légumes, de la viande et de la sauce.)

Dénombrement de la FMAT d'un produit alimentaire solide

dilutions successives

Prenons l'exemple du yaourt: Cet aliment est riche en bactérie lactique. Si vous étaliez 1 g de yaourt pur sur une gélose, vous obtiendriez une culture bactérienne en nappe. Pour éviter ce problème, il faut effectuer des dilutions successives.On a pour habitude de prélever 10g de produit de façon homogène que l'on dilue dans 90 mL d'urée-tryptophane contenu dans un sac spécial.(dilution dite pondéral, en admettant que la masse volumique du diluant est égal à 1 c'est à dire la masse volumique de l'eau; ce qui veut dire que 1 cm3 de diluant correspond à 1g.On peut peser 25g de produit et le dilué dans 225 mL de diluant (dilution 1/10) dans le cas de la recherche des salmonelles (absence dans 25 g, plan à deux classe), ce qui peut aussi servir aux autres recherches. Comme les micro-organismes peuvent être partout dans l'aliment, l'aliment va être broyé dans une machine, puis il faudra procéder comme ce qui suit

Attention : une dilution au 1/10 est déjà réalisée quand 10 g de produit sont mis dans 90 mL d'urée-tryptophane

Technique des dilutions successives

Prenez un mL du sac avec une pipette graduée, et transverser le dans un tube contenant 9 mL d'urée tryptophane. Vous venez de réaliser une dilution au 1/10 . C'est à dire que si votre lait pur contenait 10 000 bactéries/ mL votre second tube en contient maintenant 1 000 / mL. Renouveler l'opération en changeant de pipette et en versant de nouveau 1 mL dans un nouveau tube d'urée tryptophane et ainsi de suite jusqu'à ce que la concentration en bactérie devienne relativement faible. On considère que les colonies sont dénombrables si leur nombre est compris entre 30 et 300. Au dessus 300, elles sont indénombrables, en dessous 30 on considère qu'elles sont trop rares pour être dénombrées. Pour savoir quand arrêter les dilutions , référez vous aux normes des produits.

Remarques : Les dilutions doivent être faites en milieu aseptique. Homogénéisez bien vos tubes entre chaque dilution.
Une fois que vous avez fait votre dernière dilution, vous devez homogénéiser votre tube et jeter 1 mL de dilution pour avoir une égalité statistique entre les tubes. Annotez vos tubes : (E , pour échantillon puis 1,2,3,....)

Mise en gélose PCA

mise en gélose PCA

comme nous l'avons vu précédemment, la gélose PCA (Plate Count Agar) est une gélose standard pour le dénombrement. Commencez par annoter vos boites de Petri, elles doivent contenir sur la tranche :

• la date
• la dilution qui va être utilisée
• la température d'incubation
• la durée d'incubation

Attention: il devra y avoir deux boites par dilution.

Prenez une nouvelle pipette et à partir de la dernière dilution, prélevez 1 ml de dilution que vous répartirez en goutte au fond de la boite correspondante, et renouvelez l'opération pour la seconde boite. Sans changer de pipette remontez à la dilution supérieure, et recommencez et ce ainsi de suite jusqu'à la première dilution.

Recouvrez les gouttes d'une couche de gélose PCA en surfusion, et homogénéisez grâce à des mouvements circulaires.

Attention: trop chaude, la gélose tue les bactéries. 

Quand la gélose a refroidi, passer une seconde couche de gélose PCA ce qui aura pour effet d'immobiliser les bactéries, et donc de former des colonies bien définies.

mettez à incuber à 30°C pendant 24 H

Dénombrement de la FMAT d'un produit liquide

Même chose que précédemment, mais il suffira de prendre 1 ml d'échantillon et le diluer directement. Il faudra retenir, à la sortie de l'étuve, le nombre de dilutions positives, ce qui nous donnera un nombre à plusieurs chiffres (ex: 210) à reporter dans un tableau pour obtenir le nombre exact du dénombrement.

Lecture des résultats

Nous considérons que vous avez obtenu les résultats suivants pour l'analyse de 25 g de yaourt.

	Échantillon pur	Dilution $10^{-1}$	Dilution $10^{-2}$	Dilution $10^{-3}$	Dilution $10^{-4}$
Boite 1	Indénombrable	Indénombrable	295	34	3
Boite 2	Indénombrable	Indénombrable	280	31	4

Il est impossible de compter une boite contenant plus de 300 colonies. Le risque d'erreur est trop important donc elles sont écartées. Les boites contenant moins de 30 colonies sont elles aussi écartées, les colonies sont trop rares et peuvent induire en erreur.

La formule mathématique de la norme ISO 7218 de mai 1996 peut être utilisée: $N={\sum colonies \over V_{mL}\times (n_{1}+0.1n_{2})\times d_{1}}$

• $N\,$ : Nombre d'UFC par gramme ou par mL de produit initial
• $\sum colonies$ : Somme des colonies des boites retenues de deux dilutions successives
• $V_{mL}\,$: volume de solution déposée (1mL ou 0,1mL)
• $n_{1}\,$ : nombre de boites considéré à la première dilution retenue
• $n_{2}\,$ : nombre de boite considéré à la seconde dilution retenue
• $d_{1}\,$ : facteur de la première dilution retenue

Application numérique:

$N={295+280+34+31 \over 1\times (2+0.1\times 2)\times 10^{-2}}$

$N={640 \over (2.2)\times 10^{-2}}$

$N=29090\,$ UFC/gramme de yaourt, soit 2,9 10^4 UFC/g